黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡性能評(píng)價(jià)

      摘要：對(duì)上海飛測(cè)生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條在糧食谷物飼料中的檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于對(duì)糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的進(jìn)行快速定量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1檢測(cè)試紙條；熒光定量免疫層析；黃曲霉毒素B1；糧食谷物飼料

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡(jiǎn)寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?/span>，具有強(qiáng)致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認(rèn)定為世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定的一類致癌物，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素。

黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。目前，GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對(duì)糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20μg/kg。GB13078-2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)從10-50μg/kg。

目前，國標(biāo)法測(cè)定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，操作過程復(fù)雜、時(shí)間較長，且無法在現(xiàn)場(chǎng)和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測(cè)試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡(jiǎn)便快速，又能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對(duì)多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測(cè)，驗(yàn)證了上海飛測(cè)生物開發(fā)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測(cè)試紙條的技術(shù)性能。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水均為UP水。

黃曲霉毒素B1熒光熒光定量檢測(cè)試紙條（由包被有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體的乳膠墊、噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測(cè)線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測(cè)生物科技有限公司提供。

黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；

大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。

麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

1.2儀器與設(shè)備

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測(cè)生物科技有限公司提供；低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius；

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測(cè)樣品500g，用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細(xì)小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。

1.3.2檢測(cè)過程

取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實(shí)際檢測(cè)濃度。當(dāng)檢測(cè)值大于50μg/kg時(shí)，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測(cè)，所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

2檢測(cè)結(jié)果分析

2.1線性范圍與檢出限

在樣品提取液中，分別添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg 的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，用上海飛測(cè)生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次，以添加濃度為為縱坐標(biāo)，以熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：

圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系

計(jì)算得出小麥的線性范圍：1.00～50.00μg/kg（6點(diǎn)）， 回歸方程: y = 1.042x + 0.540,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998；（見圖1）。

取10個(gè)無污染（陰性）小麥樣品、10個(gè)無污染（陰性）玉米樣品和10個(gè)無污染（陰性）大米樣品，用上海飛測(cè)生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次，檢測(cè)限（LOD）為測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限(LOQ)為測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條的LOD為0.29μg/kg，LOQ為0.91μg/kg。

2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

在用國標(biāo)法測(cè)定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見表1。 

表1  不同樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

從表1可以看出，上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條測(cè)試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。
2.3與色譜方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，再使用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定，各測(cè)試3個(gè)平行樣。檢測(cè)結(jié)果如下： 

表3  黃曲霉毒素B₁熒光定量檢測(cè)卡與高效液相色譜法檢測(cè)值對(duì)比

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條與液相色譜法的符合率為89.89%~112.65%，3次重復(fù)測(cè)定的的CV值在10.29%以內(nèi)。

2.4方法特異性

選擇其他5種常見的真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加，添加的濃度為100 μg/kg，然后用飛測(cè)生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均＜5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金試劑條對(duì)伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以能滿足檢測(cè)要求。

表3 交叉反應(yīng)率表

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測(cè)試紙條對(duì)不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測(cè)試，該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對(duì)黃曲霉毒素B1的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測(cè)分析。

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