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玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條性能評(píng)估測(cè)試

時(shí)間:2016-12-18來(lái)源:飛測(cè)生物點(diǎn)擊量:

      摘要:對(duì)上海飛測(cè)生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條在糧食谷物飼料中的檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。該產(chǎn)品的最低檢出限LOD0.29μg/kg,最低定量限(LOQ)0.91μg/kg線性范圍為1.00-50.00μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%3次重復(fù)的變異系數(shù)14.56%內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),適合用于對(duì)糧食谷物飼料中玉米赤霉烯酮的進(jìn)行快速定量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞:玉米赤霉烯酮檢測(cè)試紙條;熒光定量免疫層析;玉米赤霉烯酮糧食谷物飼料

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)又稱F-2毒素,主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生。它首先從有赤霉病的玉米中分離得到,是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu),分子式為C18H22O5。玉米赤霉烯酮常污染玉米小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用,其強(qiáng)度為雌激素的十分之一,可造成家禽和家畜的雌激素水平提高。目前發(fā)現(xiàn),豬對(duì)此毒素較為敏感。玉米赤霉烯酮作用的靶器官主要是雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng),同時(shí)對(duì)雄性動(dòng)物也有一定的影響,可使家畜,家禽和實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥。妊娠期的動(dòng)物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。由于玉米赤霉烯酮具有以上危害,已經(jīng)被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生的食品污染物之一。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2011(食品中真菌毒素限量)中對(duì)谷物及其制品中的ZEN最高限量要求為60μg/kgGB 13078.2-2006 《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》,不同種類的飼料中玉米赤霉烯酮的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為500μg/kg

目前,國(guó)標(biāo)法測(cè)定玉米赤霉烯酮采用HPLC法,需要大型的儀器設(shè)備,價(jià)格昂貴,操作過(guò)程復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng),且無(wú)法在現(xiàn)場(chǎng)和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外,也有采用玉米赤霉烯酮酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測(cè)試紙條用于大量樣品的篩查,操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)快速,成本也較低,但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差,容易造成假陽(yáng)性或者假陰性。因此,急需一種既簡(jiǎn)便快速,又能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)方法,熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過(guò)對(duì)多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測(cè),驗(yàn)證了上海飛測(cè)生物開(kāi)發(fā)的玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測(cè)試紙條的技術(shù)性能。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1試劑和材料

除注明外,均為分析純,試驗(yàn)用水均為UP水。

玉米赤霉烯酮熒光熒光定量檢測(cè)試紙條(由包被有熒光微球標(biāo)記玉米赤霉烯酮抗體的乳膠墊、噴涂有玉米赤霉烯酮抗原的檢測(cè)線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成)、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測(cè)生物科技有限公司提供。

玉米赤霉烯酮及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品:購(gòu)自Sigma公司;

大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購(gòu)得或從企業(yè)取樣。

麩皮,小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

1.2儀器與設(shè)備

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000試紙條恒溫孵育器,上海飛測(cè)生物科技有限公司提供;低速離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電子天平:Sartorius;

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測(cè)樣品500g,用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過(guò)20目篩,收集過(guò)篩的細(xì)小樣品。1.0±0.02g過(guò)篩的樣品于10mL離心管中,加入5mL提取液,用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min后,4000RPM離心1min,取上清。

1.3.2檢測(cè)過(guò)程

50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中,用漩渦混勻器混勻3-5s,然后取100μL加入到玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條的加樣孔中,置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后,將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù),即為樣品的實(shí)際檢測(cè)濃度。當(dāng)檢測(cè)值大于5000μg/kg時(shí),可用提取液將離心上清液稀釋5后再進(jìn)行檢測(cè),所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

2檢測(cè)結(jié)果分析

2.1線性范圍與檢出限

在樣品提取液中,分別添加10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg、100.00μg/kg、250.00μg/kg、500.00μg/kg 1000μg/kg的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品,用上海飛測(cè)生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次,以添加濃度為為縱坐標(biāo),以熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo),擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù),結(jié)果如下:

玉米赤霉烯酮檢測(cè)卡標(biāo)準(zhǔn)曲線

1 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系

計(jì)算得出小麥的線性范圍:10.001000.00μg/kg7點(diǎn)), 回歸方程: y = 1.107x + 0.011,相關(guān)系數(shù),R2 = 0.998;(見(jiàn)圖1)。

10個(gè)無(wú)污染(陰性)小麥樣品和10個(gè)無(wú)污染(陰性)玉米樣品,用上海飛測(cè)生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次,檢測(cè)限(LOD)為測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,定量限(LOQ)為測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)試結(jié)果表明,玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條的LOD3.65μg/kg,LOQ8.51μg/kg

2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

在用國(guó)標(biāo)法測(cè)定為0的不同種類空白樣品中分別添加玉米赤霉烯酮濃度為1.00,2.50,5.00,10.0025.00,50.00μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品,然后按照玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

不同樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

樣品

玉米赤霉烯酮添加量μg/kg

 

平行實(shí)驗(yàn)

10.00

25.00

50.00

100.00

250.00

500.00

100.00

大米

1

9.32

23.21

55.87

112.63

273.97

568.39

990.21

2

8.21

25.81

58.32

109.28

291.09

582.87

965.55

3

10.67

27.78

59.45

102.63

262.22

521.42

1000.00

平均值μg/kg

9.40

25.60

57.88

108.18

275.76

557.56

--

平均回收率

94.00%

102.40%

115.76%

108.18%

110.30%

111.51%

--

變異系數(shù)CV

13.11%

8.95%

3.16%

4.71%

5.26%

5.76%

--

玉米

1

11.32

26.25

57.75

108.79

276.66

534.76

1000

2

10.85

28.76

59.21

112.87

281.39

509.81

1000

3

10.23

29.36

60.53

121.38

248.13

572.19

975.86

平均值μg/kg

10.80

28.12

59.16

114.35

268.73

538.92

--

平均回收率

108.00%

112.49%

118.33%

114.35%

107.49%

107.78%

--

變異系數(shù)CV

5.06%

5.87%

2.35%

5.62%

6.70%

5.83%

--

小麥

1

9.23

30.65

61.78

98.32

276.93

587.31

983.21

2

9.87

27.42

57.26

109.88

226.17

521.66

1000

3

10.45

28.31

55.69

105.25

291.75

554.95

1000

平均值μg/kg

9.85

28.79

58.24

104.48

264.95

554.64

--

平均回收率

98.50%

115.17%

116.49%

104.48%

105.98%

110.93%

--

變異系數(shù)CV

6.20%

5.79%

5.43%

5.57%

12.98%

5.92%

--

從表1可以看出,上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條測(cè)試不同糧食谷物中玉米赤霉烯酮的添加回收率在94.00%~118.33%,3次重復(fù)的變異系數(shù)13.11%內(nèi)。
      2.
3與色譜方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品1,先采用國(guó)標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測(cè)定,再使用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定各測(cè)試3個(gè)平行樣。檢測(cè)結(jié)果如下

表3  玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)卡與高效液相色譜法檢測(cè)值對(duì)比

樣本

大米

小麥

玉米

高粱

麩皮

噴漿玉米

DDGS

色譜值

16.76

258.32

745.72

428.29

53.81

523.54

85.32

飛測(cè)生物值

1

19.26

225.18

693.28

502.32

59.99

603.33

92.51

2

18.87

293.56

790.27

476.18

61.38

583.28

80.39

3

16.53

281.39

765.43

458.91

50.54

576.89

82.18

平均值

18.22

266.71

749.66

479.14

57.30

587.83

85.03

符合度

108.71%

103.25%

100.53%

111.87%

106.49%

112.28%

99.66%

CV

8.10%

13.68%

6.72%

4.56%

10.29%

2.35%

7.69%

2表明,在不同的糧食谷物飼料中,上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條與液相色譜法的符合率為99.66%~111.87%,3次重復(fù)測(cè)定的的CV值在13.68%以內(nèi)。

      2.4方法特異性

選擇其他5種常見(jiàn)的真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加,添加的濃度為1000 μg/kg然后用飛測(cè)生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值;結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A,伏馬菌素B1,嘔吐毒素T-2毒素、黃曲霉毒素B1交叉反應(yīng)率均<5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條對(duì)伏馬毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1幾乎無(wú)交叉反應(yīng),其方法特異性可以能滿足檢測(cè)要求。

3 交叉反應(yīng)率表

序號(hào)

名稱

測(cè)定值

交叉反應(yīng)率

1

玉米赤霉烯酮(ZEN

1000

100%

2

嘔吐毒素(DON

35.78

3.58%

3

赭曲霉毒素A (OTA)

27.21

2.72%

4

伏馬菌素B1FB1

29.52

2.95%

5

黃曲霉毒素B1(AFB1)

42.98

4.98%

6

T-2毒素(T-2)

22.87

2.29%

 

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測(cè)試紙條對(duì)不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測(cè)試,該產(chǎn)品的最低檢出限LOD3.65μg/kg,最低定量限LOQ8.51μg/kg,線性范圍為10.00-1000.00μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為94.00%~118.33%,3次重復(fù)的變異系數(shù)13.11%內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國(guó)對(duì)玉米赤霉烯酮的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn),可用于不同糧食谷物飼料中玉米赤霉烯酮的快速定量檢測(cè)分析。


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